Sangerovo sekvenciranje ili NGS?

Duže vrijeme znanstvenici su usmjereni na identifikaciju varijanti odgovornih za razna oboljenja uključujući rak, neurološke, metaboličke i razne druge poremećaje. Metode odabira donedavno su bile qPCR (real-time PCR), Sangerovo sekvenciranje, i mikročipovi (microarray). Pokretanjem projekta sekvenciranja ljudskog genoma (Human Genome Project) tehnologija je ubrzano napredovala i danas imamo sekvenciranje sljedeće generacije (Next Generation Sequencing, NGS), kao neizostavnu tehnologiju koja je omogućila ogroman napredak u poznavanju ljudskog genoma te sve širu primjenu u dijagnostici.

NGS pruža mogućnost sekvenciranja cijelog genoma u vrlo kratkom vremenu i uz sve niže troškove. Trenutno NGS ima široku primjenu u prediktivnoj medicini što znači da je sekvenciranjem dijela genoma pojedincu moguće predvidjeti predispozicije za razne poremećaje poput kardiovaskularnih bolesti, neuroloških i metaboličkih poremećaja te za razvoj velikog broja tumora. Osim toga, u zadnje vrijeme NGS poprima toliku značajnost i preciznost te se tako vidi tendencija uvođenja većeg broja dijagnostičkih testova koji će omogućiti neinvazivno dijagnosticiranje u prenatalnoj dijagnostici analizom slobodno cirkulirajuće fetalne DNA u perifernoj krvi majke te u onkologiji analizom slobodno cirkulirajuće tumorske DNA u perifernoj krvi oboljelih, neinvazivnom metodom koja se u praksu uvodi pod nazivom tekućinska biopsija (liquid biopsy).

PCR može dati informaciju o prisutnosti varijante, Sangerovo sekvenciranje može cijenovno prihvatljivo identificirati određene varijante na razini pojedinačnih nukleotida za manji broj gena ili ciljnih regija dok targetirano resekvenciranje identificira varijante u tisućama ciljnih regija na razini pojedinačnih nukleotida u jednom eksperimetu. (preuzeto s www.illumina.com “Targeted Resequencing Guide”)

Odlaze li starije tehnologije u zaborav?

Često se postavlja pitanje odlaze li stare tehnologije u zaborav i koja je njihova funkcija sada. Sangerovo sekvenciranje ipak je još uvijek zlatni standard sekvenciranja zato što unatoč slaboj procesivnosti (daje daleko manje podataka u istom vremenu) i visokoj cijeni kada su u pitanju veliki projekti, ima mogućnost čitanja dugih sekvenci visokom preciznošću.

Sangerovo sekvenciranje dobar je izbor za:

• Sekvenciranje pojedinačnih gena Sekvenciranje 1 – 100 ciljnih amplikona uz niže troškove
• Sekvenciranje do 96 uzoraka odjednom bez potrebe barkodiranja
• Identifikaciju mikroorganizama
• Fragment analizu za visokoprocesivnu genotipizaciju (SBE metodom)
• Analizu mikrosatelita ili STR-ova
• Potvrdu rezultata dobivenih NGS-om

Može li NGS u potpunosti zamijeniti Sangerovo sekvenciranje?

Ne treba zaboraviti da se tehnologija neprestano i to ubrzano razvija pa je moguće da će i te prednosti Sangerovog sekvenciranja biti nadomještene razvojem novih tehnologija. Dodatan napredak u brzini i troškovima npr. nudi targetirano NGS. Ono omogućava sekvenciranje s puno većom razinom pokrivanja što povećava preciznost sekvenciranja do razine točnosti Sangerovog sekvenciranja. Osim toga, zbog mogućnosti multiplexa, manje potrebe analize podataka i mogućnosti sekvenciranja desetaka tisuća ciljnih fragmenata u jednom eksperimentu, zadržava brzinu procesivnosti NGS-a.

NGS je dobar izbor za:

• Vremenski i cijenovno efikasno pretraživanje preko 100 gena odjednom
• Pronalazak novih varijanti povećanjem broja sekvenciranih ciljnih fragmenata u jednom run-u
• Sekvenciranje uzoraka male početne koncentracije
• Sekvenciranje genoma mikroorganizama u svrhu subtipizacije patogena kako bi se identificirale pojave epidemije

 (preuzeto s www.illumina.com “Targeted Resequencing Guide”)