PCR evolucija: od tradicionalnog i Real-Time do digitalnog PCR-a

PCR kao relativno mlada molekularna metoda je od svog početka 1983. godine ubrzano napredovala. Podsjetimo se, Kary Mullis je te godine razvio ovu metodu kao pristupačnu i jednostavnu metodu umnažanja nekog odsječka DNA. Tada vjerojatno nije ni sanjao da će doživjeti tako brz razvoj ove metode, do toga da će se moći pratiti umnažanje molekule DNA u stvarnom vremenu i odrediti točan broj umnoženih molekula DNA.

PCR danas ima široku primjenu u kliničkim laboratorijima i istraživanjima, od zasebne metode sa ciljem detekcije određene DNA u uzorku pa do daljnjih aplikacija kao što su RFLP, sekvenciranje i kloniranje. PCR je svoje mjesto pronašao i u forenzičkim laboratorijima u profiliranju kao jedinstven način razlikovanja jedinki, specifičniji od otiska prsta. Naravno ne smijemo zaboraviti spomenuti mogućnost umnažanja RNA uz prethodnu reverznu transkripciju.

Stariji model PCR uređaja sa tri temperature i prototip PCR uređaja iz 1986. godine.

Preuzeto sa en.wikipedia.org “Polymerase Chain Reaction”

Real-Time PCR

Real-Time PCR kao modernija inačica PCR-a omogućava praćenje tijeka reakcije u svakom ciklusu promjenama fluorescencijskog signala koje stvaraju DNA vezujuće boje ili specifične fluorescentno obilježene probe. Odabir Real-Time PCR eseja je uvjetovan time što želimo postići u eksperimentu.

Esej sa DNA vezujućim bojama nespecifično detektira umnažanje DNA te je dobar i jeftiniji izbor ako je potrebno odrediti prisutnost neke DNA u uzorku (npr. detekcija nekog patogena). Pritom treba paziti jer signal nastaje i kod umnažanja nespecifičnih fragmenata tako da eksperiment treba biti dobro optimiziran. Ovakav esej može biti kvalitativan ili kvantitativan, a kvantifikacija može biti relativna, gdje se količina ciljane DNA određuje uz pomoć standardne krivulje ili apsolutna, gdje se količina određuje u odnosu na količinu DNA kalibratora.

Esej kvalitativne analize, relativne i apsolutne kvantifikacije je moguće postaviti i sa specifičnim fluorescentno obilježenim probama, no u tom slučaju je moguće npr. detektirati više uzročnika u jednom uzorku ako se probe specifične za pojedine uzročnike (kratki oligonukleotidi slijeda specifičnog za ciljani produkt) obilježe različitim fluorescentnim bojama, to jest postaviti “multiplex” Real-Time PCR reakciju.

Eseji se prilagođavaju eksperimentima na RNA tako što se u jednom koraku događa reverzna transkripcija, a u drugom umnažanje cDNA, ili su oba koraka spojena u jedan (“One-tube RT qPCR”).

Esej alelne diskriminacije koristi specifično fluorescentno obilježene probe te je moguće različitim bojama razlikovati alele (npr. ciljani SNP, točkastu mutaciju ili kratku deleciju ili inserciju). Alelna diskriminacija je jako osjetljiv esej za koji je vrlo bitan kvalitetan uzorak bez inhibitora reakcije i sa ne degradiranom DNA. Za dobru alelnu diskriminaciju je potrebno u eksperimentu imati veći broj uzoraka kako bi se genotipovi mogli grupirati tijekom analize na XY osi.

Digitalni PCR (dPCR)

Digitalni PCR je trenutno posljednja inovacija u PCR liniji, a radi se najosjetljivijoj kvantitativnoj metodi za mjerenje količine DNA ili RNA u uzorku. Kvantifikacija kod digitalnog PCR-a ne ovisi o standardnim krivuljama ili kalibratorima. Početna reakcijska smjesa se razdijeli u veliki broj posebnih jažica prije početka amplifikacije što osigurava da se u svakoj jažici nalazi jedna ili nijedna ciljna molekula te se na temelju broja pozitivnih i negativnih jažica određuje točan broj molekula. Ova inovacija unaprjeđuje mogućnost detekcije rijetkih alela, povećava osjetljivost i uvelike pomaže NGS-u.

Preuzeto sa: www.labgene.ch “RainDrop Digital PCR System”

Princip rada digitalnog PCR-a.

Kako izabrati “pravi” PCR za svoj eksperiment? Slijedeća tablica može pomoći u tome:

Tablica preuzeta i prevedena sa www.thermofisher.com