Optimizacija PCR reakcije – Uvjeti reakcije – temperature i trajanje faza PCR reakcije

Kada ste napokon odlučili konačan sastav i koncentracije svih komponenti PCR reakcije treba tu reakciju i pokrenuti. I tu se pojavljuju nove nedoumice. Da bi vam sve to bilo jasnije prvo ćemo objasniti princip PCR reakcije pri čemu ćemo obratiti pozornost na osnovne varijacije uvjeta PCR reakcije u smislu temperatura i trajanja pojedinih faza PCR reakcije.

Inicijalna denaturacija

DNA je dvolančana molekula pa ju, kako bi se mogla umnožiti, prvo trebamo denaturirati. Denaturacija DNA podrazumijeva razdvajanje dvaju lanaca DNA što se odvija na temperaturi od 94 do 96⁰C. Na početku PCR reakcije potrebno je nešto duže denaturirati kako bi smo bili sigurni da će se naše ciljno mjesto otvoriti za daljnju reakciju. Ovaj korak zove se inicijalna denaturacija i traje oko dvije minute. Treba izbjegavati predugu inicijalnu denaturaciju jer Taq polimeraza može samo određeno vrijeme biti aktivna na tako visokoj temperaturi. U posebnim slučajevima, vrijeme denaturacije se može produljiti te se tada koriste polimeraze koje su dulje vremena aktivne na visokim temperaturama.

Denaturacija

Denaturacija u slijedećim ciklusima PCR reakcije traje puno kraće, obično oko 15 do 30 s, jer su i fragmenti koji se moraju denaturirati puno kraći (naša ciljana regija).

Vezivanje početnica

Nakon denaturacije DNA slijedi faza vezivanja početnica (eng. annealing) na DNA kalup. U ovoj fazi temperatura se snižava što omogućava vezivanje dviju sintetiziranih početnica duljine oko 20 nukleotida na komplementarne lance DNA kalupa (svaka početnica, uzvodna ili nizvodna, veže se na drugi lanac DNA). Temperatura vezivanja u pravilu je 5⁰C ispod temperature topljenja (eng. melting temperature) početnica. Konačna temperatura vezivanja može se potvrditi isključivo empirijski, ali izračunata temperatura nam može služiti kao polazna točka za optimizaciju. Faza vezivanja početnica obično traje 15 do 30 s.

Elongacija

Nakon vezivanja početnica, u fazi elongacije (eng. extension) polimeraza ugrađuje nukleotide pri čemu se sintetizira novi lanac DNA. Taq polimeraza najaktivnije je pri temperaturi 72⁰C pa se elongacija odvija na toj temperaturi. Duljina elongacije ovisi o duljini ciljanog fragmenta. Što je fragment veći, polimeraza će trebati više vremena da sintetizira novi lanac do kraja. Generalno je za 1000 nukleotida potrebna jedna minuta (dakle, za 500 nukleotida, 30 s, a za 2 kb, 2 min). Brzina ugrađivanja novih nukleotida ovisi od polimeraze do polimeraze i uvijek je naznačena u specifikacijama proizvođača.

Ciklusi

Kako bi se umnožio dovoljan broj kopija željenog fragmenta faze denaturacije, vezivanja i elongacije ponavljaju se u ciklusima 25 – 35 puta, idealno 30. Umnožavanje se odvija eksponencijalno. Premalo ciklusa može uzrokovati da se premalo produkta generira do kraja reakcije. Previše ciklusa može uzrokovati značajno umnažanje neželjenih produkata kojih bi se u manjem broju ciklusa, umnožilo zanemarivo malo. Idealan broj ciklusa je nekad potrebno empirijski odrediti.

Finalna elongacija

Na kraju slijedi finalna elongacija na 72⁰C u kojoj se konačno produljuju produkti koji su eventualno ostali neproduljeni do kraja. Nakon finalne elongacije temperatura se snižava na 4⁰C, beskonačno, odnosno do trenutka kada izvadimo tubice iz uređaja. Snižavanje temperature na 4⁰C sprječava daljnje odvijanje reakcije.

O primjenama PCR-a

Produkt PCR-a može se analizirati gel elektroforezom i/ili koristiti u razne svrhe za daljnju analizu. Za aplikacije poput RFLP analize ili sekvenciranja, izuzetno je važno da je PCR reakcija dobro optimizirana i da na kraju dobivamo zadovoljavajuću količinu ciljanog fragmenta te da pri tom nema nespecifičnih produkata.

Kao mala zanimljivost za kraj, PCR reakciju 80-ih godina razvio je Dr. Mullis. Tada još nije bila izolirana termostabilna Taq polimeraza, pa se polimeraza dodavala nakon svakog koraka denaturacije. Također, nisu postojali sofisticirani uređaji s mogućnostima brzog snižavanja i povisivanja temperature pa su se tubice s reakcijskom smjesom ciklički premještale između triju vodenih kupelji različitih temperatura.