Kada se nađete u situaciji da prvi put postavljate PCR reakciju, a nitko vam nije servirao protokol, naići ćete na mnoga pitanja. Na fakultetu ste naučili sve što se može znati o PCR-u. Koje su komponente smjese za PCR reakciju, koje su faze PCR reakcije, koliko kopija produkta se sintetizira iz jedne kopije kalupa nakon n ciklusa… Ipak, stotine pitanja kada pripremate prvi vlastiti protokol za PCR reakciju.
Ovako izgleda jedan standardni protokol za PCR reakciju:
| Komponenta | Za ukupno 50 μl reakcije | Konačna koncentracija |
| 10X Taq pufer | 5 μl | 1X |
| 10 mM dNTP-ovi | 1 μl | 200 µM |
| 10 µM uzvodna početnica | 1 μl | 0.2 µM (0.05–1 µM) |
| 10 µM nizvodna početnica | 1 μl | 0.2 µM (0.05–1 µM) |
| DNA kalup | varijabilno | <1,000 ng |
| Taq DNA polimeraza | 0.25 µl | 1.25 U/50 µl PCR |
| dH2O | do 50 µl |
Uvjeti PCR reakcije:
| KORAK | TEMP | VRIJEME | BROJ CIKLUSA |
| Inicijalna denaturacija | 95°C | 2 – 5 min | 1 |
| Denaturacija | 95°C | 15-30 s | |
| Sparivanje početnica | 45-68°C | 15-60 s | 30 |
| Ekstenzija | 68°C | 1 min | |
| Konačna ekstenzija | 72°C | 5 – 10 min | 1 |
| 4°C | ∞ |
Već na prvi pogled postavljaju se neka pitanja. Ako imate malo sreće, nećete imati problema s dobivanjem produkta PCR reakcije sljedeći ovaj standardni protokol. Ako niste jedan od tih sretnika, na teži način ćete naučiti sve tajne PCR-a.
Na koja sve pitanja možete naići kod postavljanja PCR reakcije čitajte u slijedećim postovima.
0 responses on "Optimizacija PCR reakcije - Protokol"