Optimizacija PCR reakcije – Protokol

Kada se nađete u situaciji da prvi put postavljate PCR reakciju, a nitko vam nije servirao protokol, naići ćete na mnoga pitanja. Na fakultetu ste naučili sve što se može znati o PCR-u. Koje su komponente smjese za PCR reakciju, koje su faze PCR reakcije, koliko kopija produkta se sintetizira iz jedne kopije kalupa nakon n ciklusa… Ipak, stotine pitanja kada pripremate prvi vlastiti protokol za PCR reakciju.

Ovako izgleda jedan standardni protokol za PCR reakciju:

 

Komponenta	Za ukupno 50 μl reakcije	Konačna koncentracija
10X Taq pufer	5 μl	1X
10 mM dNTP-ovi	1 μl	200 µM
10 µM uzvodna početnica	1 μl	0.2 µM (0.05–1 µM)
10 µM nizvodna početnica	1 μl	0.2 µM (0.05–1 µM)
DNA kalup	varijabilno	<1,000 ng
Taq DNA polimeraza	0.25 µl	1.25 U/50 µl PCR
dH2O	do 50 µl

 

Uvjeti PCR reakcije:

 

KORAK	TEMP	VRIJEME	BROJ CIKLUSA
Inicijalna denaturacija	95°C	2 – 5 min	1
Denaturacija	95°C	15-30 s
Sparivanje početnica	45-68°C	15-60 s	30
Ekstenzija	68°C	1 min
Konačna ekstenzija	72°C	5 – 10 min	1
	4°C	∞

 

Već na prvi pogled postavljaju se neka pitanja. Ako imate malo sreće, nećete imati problema s dobivanjem produkta PCR reakcije sljedeći ovaj standardni protokol. Ako niste jedan od tih sretnika, na teži način ćete naučiti sve tajne PCR-a.

Na koja sve pitanja možete naići kod postavljanja PCR reakcije čitajte u slijedećim postovima.

 

Za sada se odmorite i ispitajte svoje znanje PCR-a uz naš kviz:

[contact-form-7 id=”309″ title=”PCR pitanja”]