Količina DNA koju dodajemo u reakciju ima značajan utjecaj na ishod PCR-a pa ćemo ovoj komponenti PCR reakcije posvetiti čitav članak. DNA koju dodajemo u reakcijsku smjesu sastoji se od ciljnog fragmenta i ostatka DNA. Omjer ciljnog fragmenta prema ukupnoj DNA ovisi o izvoru DNA (plazmid, viralna DNA, humana DNA itd.) te o broju kopija ciljnog fragmenta unutar genoma. Pravilo je da reakcija treba sadržavati oko 104 kopija ciljane sekvence što je 25 – 100 ng humane genomske DNA ili 1 pg – 1 ng plazmidne i viralne DNA.
Premalo DNA u PCR reakciji
Iako je teoretski dovoljna jedna kopija ciljne sekvence kako bi se ona umnožila u PCR reakciji, 25 – 30 ciklusa PCR reakcije u realnosti nije dovoljno kako bi se ta mala količina produkta detektirala. Osim toga, kada je količina DNA u PCR reakciji ekstremno mala, povećana je vjerojatnost gubitka zbog grušanja, adsorpcije na stjenke tube, kemijske ili enzimatske degradacije. Nadalje, mala količina ciljne DNA povećava i vjerojatnost kontaminacije uzorka stranom DNA ili nukleazama (DNazama).
Previše DNA u PCR reakciji
Ako razmišljate: „Zašto onda komplicirati, za svaki slučaj dodat ću više DNA“… Po pitanju količine DNA u reakciji nekad vrijedi izreka „Manje je više“. Nekoliko je razloga zašto previše DNA može kompromitirati PCR reakciju.
Prvi i najviše spominjani razlog su inhibitori PCR reakcije. Prilikom ekstrakcije DNA iz raznih izvora, u uzorku zaostaju razni inhibitori PCR reakcije. Inhibitori PCR reakcije mogu inaktivirati DNA polimerazu, degradirati ili „zarobiti“ nukleinsku kiselinu. Što veći volumen uzorka dodamo u reakciju, veća je koncentracija inhibitora i veća je vjerojatnost da reakcija neće uspjeti.
Previše DNA rezultirati će kondenzacijom u manji prostor što će dovesti do smanjene sinteze DNA zbog slabije difuzije velike molekule Taq polimeraze. Važno je također napomenuti da se početnice vežu na brojna mjesta u ukupnoj DNA koja se izolira iz uzorka. Sva ta mjesta iniciraju sintezu jednolančane DNA u prvom ciklusu. Produkt PCR reakcije nastaje samo kad obje početnice iniciraju umnažanje istog produkta u sljedećim ciklusima. Ako u početku imamo previše DNA koja potakne početno umnažanje velikog broja fragmenata, količina početnica i ostalih komponenata PCR reakcije mogu se prebrzo iscrpiti prije nego što se umnoži dovoljan broj kopija naše ciljane sekvence.
DNA molekula vezuje magnezijeve ione koji su od esencijalne važnosti za aktivnost Taq polimeraze. Što je više DNA u reakciji, manje magnezija će biti dostupno Taq polimerazi što će smanjiti njenu aktivnost.
U literaturi se spominje još nekoliko teorija mehanizma inhibicije PCR reakcije velikom količinom DNA. Važno je znati da prevelika količina DNA u reakciji može uzrokovati probleme, te u slučaju da ne dobivate produkt PCR reakcije, uzeti i to u obzir kao jedan od uzroka.
Evo nekoliko mozgalica za vas… Kada pošaljete svoje odgovore, primit ćete točne odgovore.
0 responses on "Optimizacija PCR reakcije – DNA kalup"