Kao što smo spomenuli u jednom od prijašnjih članaka o optimizaciji, za uspješnu PCR reakciju jedan od ključnih preduvjeta je dizajn početnica. Iako smo objasnili na koji način koncentracija početnica može utjecati na produkt reakcije, ostali smo dužni objasniti kako se odabiru pravilne početnice.
Početnice su kratke sintetizirane jednolančane DNA koje služe kao klica DNA polimerazi za početak sinteze novog lanca DNA.
Postoji nekoliko načina za odabir početnica:
- Pronalazak početnica za željeni produkt u znanstvenoj literaturi
- Dizajn početnica prema određenim smjernicama
- Dizajn početnica pomoću programa za dizajn početnica
Svako od ovih rješenja ima i prednosti i mane, te je svako od njih primjenjivo u različitim situacijama.
Pronalazak početnica za željeni produkt u znanstvenoj literaturi:
+ ako nemate poznati slijed željenog produkta, niti slijed koji obuhvaća željeni produkt
+ već je netko optimizirao i dobio dobar rezultat s postojećim početnicama
– preduvjet da je netko već istraživao regiju od vašeg interesa
– iz raznih razloga početnice u znanstvenoj literaturi mogu biti pogrešne i poželjno je provjeriti njihovo vezivanje na željeno mjesto te pravilnu orijentaciju (početnice se u pravilu navode u smjeru 5′ prema 3′ ako nije izričito naglašeno drugačije)
– veličina fragmenta obuhvaćenog početnicama iz znanstvene literature iz raznih razloga ne mora odgovarati potrebama vašeg eksperimenta
Dizajn početnica prema određenim smjernicama:
+ ne postoje početnice objavljene u znanstvenoj literaturi
+ software za dizajn početnica ne daje početnice koje odgovaraju potrebama eksperimenta
– zahtjevno udovoljiti svim preporučenim smjernicama
– oduzima puno vremena
Program za dizajn početnica:
+ jednostavno i brzo
+ on-line dostupne verzije programa
+ odabir između različitih kombinacija početnica omogućava podešavanje veličine produkta potrebama svakog eksperimenta
– poznati slijed željenog produkta
– ponekad ne daje početnice koje odgovaraju potrebama eksperimenta (rijetko, jer je moguće podešavati parametre za dizajn)
Ovo su osnove odabira početnica. Kako biste pravilno odabrali početnice dobro je znati koje su to zadane smjernice za dizajn, ne samo kako biste ih znali ručno odabrati, već i kako biste razumjeli programe za odabir početnica te na taj način mogli modificirati parametre. Na našim tečajevima biti ćete u mogućnosti saznati sve o dizajnu početnica te se upoznati s najkorištenijim programima.
Provjerite svoje razumijevanje i znanje o odabiru početnica kroz naš kviz:
0 responses on "Dizajn početnica za PCR"