Optimizacija PCR reakcije – Općeniti savjeti prije započinjanja

U prošlom članku naveli smo vam standardni protokol za PCR reakciju. U ovom članku ćemo spomenuti nekoliko općenitih savjeta prije započinjanja.

 

Početne koncentracije komponenti reakcijske smjese

Kako bi eliminirali nepotrebno ponavljanje PCR reakcija dobro je provjeriti slažu li se početne koncentracije svih komponenti iz protokola s koncentracijama reagensa koje imate u vašem laboratoriju. Ako se ne slažu, sve što trebate je preračunati po jednoj jednostavnoj formuli koja će vam u laboratoriju često trebati:

Pri čemu je:

c₁ – početna koncentracija

V₁ – početni volumen

c₂ – konačna koncentracija

V₂ – konačni volumen

Za vas, koje još uvijek zbunjuje mjerna jedinica kojom su izražene koncentracije u protokolu – M, mM ili µM (molarno, milimolarno, mikromolarno), one se odnose na molarnu ili množinsku koncentraciju, a isto su što i mol/L, mmol/L, µmol/L ili službeno prema SI sustavu mol dm^-3. Dakle, M =mol/L = mol dm^-3.

Na primjeru ćemo izračunati koncentraciju deoksinukleotida. U protokolu je početna koncentracija (c₁) deoksinukleotida (dNTP) 10 mM, a mi smo od proizvođača nabavili 2,5 mM. Ako želimo dobiti 200 µM dNTP (c₂) u konačnom volumenu reakcije 50 μL (V₂), onda trebamo izračunati koliki volumen (V₁) 2,5 mM dNTP-ova trebamo dodati u reakciju:

Ovdje je još važno obratiti pozornost da se jedinice početne i konačne koncentracije ne slažu pa ih moramo ujednačiti.

Jednostavnom logikom: ako je početna koncentracija naših dNTP-ova 4 puta manja od početne koncentracije dNTP-ova u protokolu (10 mM/2,5 mM=4), moramo ih dodati 4 puta više kako bi zadržali istu konačnu koncentraciju u reakcijskoj smjesi (1 μL*4=4 μL).

Na isti način podesit ćemo izračun za sve ostale komponente reakcijske smjese.

 

Ukupni volumen reakcijske smjese

 

Drugo, uvijek promislite koliki ukupni volumen reakcije trebate. Najčešće u protokolima proizvođača stoji ukupni volumen od 50 µL. Dok optimizirate PCR reakciju moguće je i smanjiti početni volumen reakcije. Ako smanjite volumen reakcije, snizit ćete troškove. Naravno, pri tome ne smijete pretjerati. Svaki uređaj za PCR ima preporučen minimalni volumen reakcije. Jednom kad imate optimiziranu PCR reakciju, razmislite za što ćete koristiti produkt PCR reakcije i prema tome odredite ukupni volumen reakcije. Ako ćete ga koristiti za analizu na gelu, onda je već najmanji volumen dovoljan, ali ako vam treba za restrikciju, kloniranje ili slično trebat ćete veće volumene.

Nažalost, ovo što ste mogli naučiti iz prva dva članka o optimizaciji PCR reakcije često neće biti dovoljno za uspješno dobivanje PCR produkta. Nakon što smo vam objasnili kako izgleda osnovni protokol za PCR reakciju i dali nekoliko općenitih savjeta, u sljedeća dva članka usredotočit ćemo se na pojedine komponente PCR reakcije te na pojedine korake programa PCR reakcije.

 

Za provjeru svog znanja pošaljite nam odgovore na sljedećih nekoliko pitanja: