Optimizacija PCR reakcije – Ostale komponente reakcijske smjese – koliko i zašto?

Nakon što smo vam pokazali kako izgleda osnovni protokol za PCR reakciju i malo detaljnije objasnili kako količina DNA kalupa može pozitivno i negativno utjecati na ishod reakcije, sada ćemo objasniti i okvirna pravila po kojima se određuju količine svih ostalih komponenti PCR reakcije te na što još treba obratiti pozornost. Ovaj članak će vam približiti kako veća i manja koncentracija može utjecati na reakciju kako bi što više toga mogli predvidjeti prije početka reakcije. Nažalost, idealnu koncentraciju moguće je podesiti samo empirijski tako da nekad sva predviđanja nisu preduvjet za dobru reakciju

 

Početnice

Početnice su kratke sintetizirane jednolančane DNA koje služe kao klica DNA polimerazi za početak sinteze novog lanca DNA. Za uspješnu PCR reakciju jedan od ključnih preduvjeta je dizajn početnica. Sada ćemo se usredotočiti na optimizaciju reakcije kada već imamo početnice. Konačna koncentracije početnica može se varirati u rasponu od 0,05 – 1 µM, obično je količina 0,2 µM dobra startna koncentracije u optimizaciji, a optimalnu koncentraciju moguće je odrediti samo empirijski.

Ako je koncentracija početnica prevelika, veća je vjerojatnost nespecifičnog vezanja početnica na neželjene sekvence kalupa DNA ili međusobno vezivanje početnica (samodimerizacija početnica ili unakrsna dimerizacija početnica). Naprotiv, preniska koncentracija početnica može uzrokovati slabu efikasnost vezivanja na kalup DNA.

 

Magnezij

Magnezij je kofaktor ključan za aktivnost Taq DNA polimeraze. Optimalna koncentracija magnezija (Mg²⁺) u PCR reakciji je između 1,5 – 2,0 mM. Važno je znati da konačna koncentracija SLOBODNOG magnezija u reakciji ovisi o prisutnosti raznih komponenti koje također vežu magnezijeve ione. To su sama DNA, dNTP-ovi, EDTA prisutna u puferima te proteini. Zbog toga je optimalnu koncentraciju magnezija za svaku pojedinu reakciju moguće odrediti isključivo empirijski Također je vrlo važno provjeriti sadrži li pufer za PCR magnezij kako ne biste pretjerali s količinom. Ako vaš pufer sadrži magnezij, izračunajte koliko magnezija sadrži 1x koncentrirani pufer kako biste odlučili trebate li dodatni magnezij te uzmite u obzir tu količinu kad izračunavate koliko još magnezija treba dodati.

U nedostatku magnezija Taq polimeraza je neaktivna što uzrokuje slab ili nikakav produkt PCR reakcije. Višak slobodnog magnezija umanjuje preciznost DNA polimeraze, a pored toga stabilizira kompleks početnica s kalupom DNA što ponovno može uzrokovati umnožavanje neželjenih fragmenata DNA.

Slika 1. Primjeri PCR reakcija vizualiziranih razdvajanjem elektroforezom na agaroznom gelu (u prvoj jažici na svakoj od tri slike je molekularni marker). A. Produkt PCR reakcije izostao. B. Produkt dobro optimizirane PCR reakcije. C. Nespecifična PCR reakcija, vidljivi su produkti raznih veličina.

 

Deoksinukleotidi (dNTP-ovi)

Optimalna koncentracija svakog dNTP-a (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) u reakcijskoj smjesi je obično 200 µM te je općenito najmanje kritična komponenta ako se držite preporučenog raspona. Manje koncentracije dNTP-ova, 50 – 100 µM, povećavaju vjernost (preciznost) replikacije, ali umanjuju prinos PCR reakcije. Malo veće koncentracije povećavaju prinos na štetu vjernosti (preciznosti) replikacije.

Ako ste pozorno čitali članak do sad već možete pretpostaviti zašto jako velike koncentracije dNTP-ova mogu inhibirati PCR reakciju. dNTP je helirajući agens što znači da na sebe veže ione magnezija. Jako velika količina dNTP-ova vezuje sav slobodan magnezij u reakcijskoj smjesi zbog čega je magnezij nedostupan polimerazi pa je ona neaktivna i ne nastaje produkt PCR reakcije. U ranim danima našeg laboratorija, u ovo smo se uvjerili zbog nepažnje i ne-čitanja koncentracija na tubicama proizvođača. U reakciju smo dodali 5x veću koncentraciju dNTP-ova i produkt je potpuno izostao. Na svu sreću vrlo brzo smo uočili tu pogrešku, ali kad ste u novom laboratoriju gdje je potencijalni problem sve od ispravnosti opreme do kemikalija, ovakva banalna pogreška i kao što je rečeno, obično najmanje problematična komponenta PCR reakcije, vas može koštati dosta vremena i materijala.

 

DNA polimeraza

Taq DNA polimeraza, kada je kvalitetna, također ne predstavlja veliki problem u optimizaciji PCR reakcije. Najčešće se u reakciju stavlja 0,5–3,0 jedinice u 50 µL reakcijske smjese. Svaki proizvođač ima svoju preporučenu količinu koje se najbolje držati. Pripaziti treba na to da se za razliku od ostalih komponenti reakcije, gdje se količina navodi po mikrolitru reakcije, količina DNA polimeraze navodi za ukupni volumen reakcije. Ako u reakciu stavite premalo Taq polimeraze, dobit ćete slab produkt, dok će prevelika količina uzrokovati nastanak nespecifičnih produkata.

Pored Taq polimeraze postoje i druge vrste polimeraza koje se koriste u različite svrhe kada Taq polimeraza ne udovoljava potrebama eksperimenta.

 

Dodatni savjeti:

• Početnice i nukleotide otapati na ledu
• Reakcijsku smjesu držati na ledu prije stavljanja u PCR uređaj
• Prvo dodavati veće volumene (voda, pufer za PCR…)
• DNA kalup dodati predzadnji
• Polimerazu dodati zadnju
• Polimerazu izvaditi iz zamrzivača neposredno prije dodavanja i vratiti u zamrzivač čim se doda u reakciju
• Za veći broj reakcija pripremiti mastermix
• U eksperiment uvijek uključiti pozitivnu i negativnu kontrolu